بانک جزوات و مقالات تخصصی و کاربردی ترجمه ® ویژه دروس پزشکی ®

میکرو ارگانیزم‌ها، مانند باکتری‌ها و قارچ‌ها، در حال تبدیل شدن به یک منبع در حال ظهور برای توسعه تخریب پلاستیک پایدار سازگار با محیط‌زیست و فرایندهای بازیافت هستند.

در این مطالعه، محتوای شکمبه گاو (‏Bos taurus)‏از نظر آنزیم‌های هیدرولیز کننده پلی استر مصنوعی براساس این واقعیت که رژیم غذایی نشخوارکنندگان ممکن است حاوی پلی استره‌ای گیاهی طبیعی باشد، مورد بررسی قرار گرفت.

غربالگری با سوبستراهای مدل، فعالیت‌های هیدرولیتیکی مایع شکمبه را در استره‌ای p - NP با چهار تا هشت اتم کربن نشان داد.

پلی استره‌ای آروماتیک سنتز شده با مایع Rumen با مقادیر بالاتری از ترفتالیک اسید آزاد شده از پلی (‏بوتیلن آدیپات - کو - ترفتالات)‏(‏PBAT)‏(‏به ترتیب ۰.۷۵ و ۰.۵ میلی مولار برای پودر پلیمر و فیلم)‏و در نتیجه در مقایسه با hydrolysis دومین پلیمر بر پایه ترفتالیک اسید - پلی (‏اتیلن ترفتالات)‏(‏PET)‏بیشتر است.

علاوه بر این، مایع شکمبه پلی استر زیستی (‏اتیلن فورانوات)‏(‏PEF)‏را با توجه به تجزیه و تحلیل HPLC و SEM هیدرولیز می‌کند.

در میان فراوان‌ترین جنس‌های موجود در این مطالعه، فعالیت هیدرولیز پلی استر در حال حاضر ثابت شده‌است (‏برای مثال، سودوموناس)‏. ​

کلمات کلیدی: هیدرولیز، بازیافت، جوامع میکروبی، شکمبه، آنزیم‌های تجزیه‌کننده پلی استر

3.1 مقدمه

در اروپا، مصرف گسترده زباله‌های پلاستیکی منجر به تجمع ۲۵.۸ میلیون تن زباله در محیط خشکی و دریایی شد، که پلی استرها تقریبا ۱۵ % آن را تشکیل می‌دهند (‏پلاستیک اروپا و EPRO، ۲۰۱۹)‏. اخیرا افزایش آگاهی عمومی و تغییر قوانین، توسعه استراتژی‌های جدید برای کاهش این مشکل زیست‌محیطی عظیم را تحت فشار قرار داده‌است. علاوه بر این، در دو دهه گذشته، مفهوم اقتصاد زیستی، جامعه علمی را به تمرکز بر تولید پلی استره‌ای زیست - پایه و / یا زیست تخریب پذیر و / یا فن‌آوری‌ها برای بازیافت میکروبی یا آنزیمی تشویق کرد. در نتیجه، کاربرد آنزیم‌های بسیار خاص امکان بازیابی گام‌به‌گام بلوک‌های ساختمانی بسیار ارزشمند از مخلوط پلاستیک و یا جریان‌های زباله مخلوط را فراهم می‌کند. مطالعات قبلی از گروه ما و دیگران، پتانسیل آنزیم‌ها را برای هیدرولیز پلی (‏اتیلن ترفتالات)‏(‏PET)‏، مهم‌ترین پلی استر مصنوعی مورد استفاده در کاربردهای متعدد از جمله منسوجات و بسته‌بندی نشان داده‌اند. به غیر از PET، دو پلی استر دیگر که اخیرا مورد توجه قرار گرفته‌اند در این مطالعه مورد ارزیابی قرار گرفتند، یعنی پلی (‏بوتیلن آدیپات - کو ترفتالات)‏زیست تخریب پذیر (‏PBAT)‏و پلی (‏اتیلن فورانوات)‏biobased (‏PEF)‏. PBAT یک کوپلیمر متشکل از یک بخش آلیفاتیک (‏واحدهای آدیپیک اسید و ۱، ۴ بوتان دی آل)‏و یک بخش آروماتیک (‏ترفتالیک اسید)‏است. (Biundo et al., 2016) PBAT به لطف ویژگی‌های خود، کاربردهایی را عمدتا به عنوان مواد بسته‌بندی غذا و کیسه‌های پلاستیکی قابل فشرده‌سازی پیدا می‌کند و در نتیجه حضور زنجیره‌های آلیفاتیک، مواد را قابل فشرده‌سازی می‌کند. از سوی دیگر، PEF بر پایه ۲ و ۵ - فوراندریو کربوکسیلیک اسید است که از منابع تجدید پذیر تولید می‌شود (‏وینبرگر و همکاران، ۲۰۱۷ الف)‏. چندین مطالعه تعریف کرده‌اند که خواص مکانیکی (‏به عنوان مثال، مانع گازی اکسیژن، دی‌اکسید کربن و بخار آب)‏PEF با PET قابل‌مقایسه هستند، در حالی که منشا زیستی می‌تواند به شدت انتشار گازهای گلخانه‌ای را کاهش دهد. در حالی که هیدرولیز آنزیمی این پلی استرها گزارش شده‌است، هنوز تقاضای زیادی برای آنزیم‌های کارآمدتر وجود دارد که امکان اجرای صنعتی را فراهم می‌کند. علاوه بر کشت - محور و یا در حالت سیلیسی، غربالگری میکروارگانیسم‌های تجزیه‌کننده پلی استر و آنزیم‌های آن‌ها در نهایت به دنبال مهندسی ژنتیک، روش‌های متاژنومیک اجازه ارزیابی آنزیم‌های تولید شده توسط میکرو ارگانیسم‌هایی که تقریبا در هر جایگاه در بیوسفر با نقش‌های متمایز در اکوسیستم زندگی می‌کنند را می‌دهد. (Yoshida et al., 2016; Biundo et al., 2018)

با استفاده از رویکرد بالا، آنزیم‌های هیدرولیز کننده پلی استر میکروبی از اکوسیستم‌های مختلف از جمله کمپوست شاخه برگ، محیط‌های دریایی و مرتبط با خزه شناسایی شده‌اند. (Sulaiman et al., 2012; Pinnell and Turner, 2019; Müller et al., 2017) آنزیم‌های شناسایی‌شده عمدتا آنزیم‌های برشی میکروبی هستند که قادر به هیدرولیز کوتین پلی استر گیاهی طبیعی، جز اصلی دیواره سلول گیاهی هستند. ​

به دنبال غربالگری متاژنومیک , هیدرولازهای مختلف با توانایی تجزیه پلی استر , از اکتینوباکترها (‏ به عنوان مثال , ترموبیدا spp . )‏ و از قارچ‌ها (‏ فوزاریوم solani , هامکولا اینفانز , آسپرژیلوس spp . (Ribitsch et al., 2013; Wei and Zimmermann, 2017) متعاقبا، برخی از هیدرولازهای جدید برای بهبود بیشتر فعالیت‌های خود بر روی پلی استره‌ای سنتزی مهندسی شدند. (Ribitsch et al., 2013) با این حال، هنوز هم بسیاری از اکوسیستم‌ها برای فعالیت‌های پلی استر - هیدرولیزیشن مورد بهره‌برداری قرار می‌گیرند. ​

Ruminants ها گروهی از پستانداران گیاه خوار هستند که به خوبی مطالعه شده‌اند. آن‌ها پیش معده، شکمبه‌ای (‏یا به طور دقیق‌تر رتیکولومن)‏را تکامل داده‌اند که یک محفظه بزرگ (‏ظرفیت ۵۰ تا ۱۰۰ لیتر در گاوه‌ای بالغ)‏است که در آن خوراک بلعیده‌شده قبل از هضم واقعی حیوانات، در معرض تجزیه میکروبی قرار می‌گیرد. محتوای موجود در شکمبه کاملا ناهمگن است و شامل توده‌ای از جسم شناور (‏علوفه)‏، رسوب، مایعات و سلول‌های میکروبی است. (Gijzen et al., 1987) اکو سیستم‌های شکمبه، در این مفهوم، می‌توانند به عنوان یک "کموستات" تعریف شوند که در آن واکنش‌های بیوشیمیایی مختلفی رخ می‌دهند. در میان این آنزیم‌ها، هیدرولیز آنزیمی، به عنوان مثال، سلولز (‏hemi)‏و آنزیم‌های مسئول به شدت مورد مطالعه قرار گرفته‌اند، در حالی که سایر آنزیم‌های تجزیه‌کننده پلیمر که به طور بالقوه در شکمبه وجود دارند، هنوز تحت بررسی هستند. با این حال، رژیم غذایی نشخوارکنندگان ممکن است حاوی پلی استره‌ای گیاهی طبیعی (‏کوتین)‏باشد و بنابراین آنزیم‌های دارای فعالیت‌های هیدرولیتیک ممکن است در شکمبه وجود داشته باشند. (Mao et al., 2013) در نتیجه، هدف اصلی این مطالعه، کشف جامعه میکروبی شکمبه از حیوانات نشخوار کننده با توجه به فعالیت‌های آنزیم پلی استر خوار بود. ​

مواد و روش‌ها

مواد شیمیایی و Substrates

اجزای بوفر، آلبومین سرم گاوی (‏BSA)‏، پارانیتروفنیل - استرها (‏p - NP - استرها)‏، ترفاتالیک اسید (‏Ta)‏و فرمیک‌اسید از سیگما - آلدریچ (‏ایالات‌متحده)‏خریداری شدند. مایع تازه شکمبه از یک کشتارگاه (‏مایر، ناترز، اتریش)‏که از یک چراگاه آلپاین تغذیه می‌شد، به دست آمد. ۲ ساعت پس از نمونه‌گیری، شکمبه به اندازه ۲ میلی متر الک شد و بلافاصله در دمای ۲۰ درجه سانتی گراد تا شروع آزمایش‌ها نگهداری شد. ​

پودر پلی (‏اتیلن ترفتالات)‏(‏PET)‏و فیلم از گودمن (‏انگلستان)‏خریداری شدند. پودر و فیلم پلی بوتیلن آدیپات - کو - ترفتالات (‏PBAT)‏از بزف (‏آلمان)‏تهیه شد. پودر و فیلم پلی (‏اتیلن فورانتوات)‏(‏PEF)‏توسط کوربون (‏هلند)‏تهیه شد. وزن مولکولی (‏kDa)‏در جدول تکمیلی ۱ فهرست شده‌است. تمام مواد شیمیایی و معرف‌های دیگر از سیگما - آلدریچ خریداری شدند و در درجه معرف استفاده شدند، بدون اینکه خالص‌سازی شوند اگر در غیر این صورت مشخص نشوند. ​

روش های غلظت پروتئین و روش فعالیت استراز

pH در شکمبه در شرایط طبیعی بین ۶ (‏در مورد اسیدوز حیوان)‏و کمی بالاتر از ۷ است. (Mao et al., 2013) از آنجایی که قرار گرفتن در معرض اکسیژن منجر به اسیدی شدن سریع شکمبه می‌شود، نمونه‌های ذوب شده‌شکمبه‌ای در ۱۰۰ میلی مولار pH ۷ بافر فسفات پتاسیم با نسبت ۱: ۱۰ رقیق شدند و به مدت ۲ ساعت در ۱۵۰ دور در دقیقه همزده شدند. فعالیت‌های استراز با p - نیتروفنیل (‏p - NP)‏- استرها به عنوان سوبستراها اندازه‌گیری شدند: p - NP - استات (‏p - NPA، C۲)‏، p - NP - بوتیرات (‏p - NPB، C۴)‏، p - NP - هگزانوات (‏p - NPH، C۶)‏، p - NP - octanoate (‏p - NPO، C۸)‏، p - NP - هگزانوات (‏Canoate، NPD)‏. غلظت پروتئین با توجه به سنجش پروتیین Bio - Rad تعیین شد. ​

تجزیه آنزیمی پودرها و فیلم‌های پلی مر

به طور خلاصه، ۵ میلی‌گرم از پودر پلیمر (‏PET، PBAT و PEF)‏با ۲.۰ میلی‌لیتر از محلول شکمبه انکوبه شدند. Incubations به مدت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت در یک شیکر مداری در دور ۱۵۰ rpm و تقلید از دمای شکمبه (‏یعنی ۴۰ درجه سانتی ¬ گراد)‏انجام شد. واکنش‌های خالی در بافر انجام شد. همه واکنش‌ها در سه تکرار انجام شدند. (Quartinello et al., 2017)

نمونه‌های فیلم آمورف PET، PBAT و PEF از ۰.۵ ۰ / ۱ سانتی متر سه بار همانطور که قبلا توسط وچیاتو و همکاران (‏۲۰۱۷)‏توضیح داده شد، شسته شدند. پس از شستشو، فیلم‌ها با ۲ میلی‌لیتر از نمونه‌های شکمبه الک شده به مدت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت انکوبه شدند. با همان شرایط انکوباسیون پودر انجام شد. به منظور بررسی فعالیت میکروارگانیسم‌های مختلف بر روی پلی استرها از قارچ Penicillium citrinum، beauveria bassiana و شبه آلکالیژنزهای سودوموناس جدا و همانطور که قبلا توضیح داده شد کشت شدند. (Liebminger et al., 2007; Almansa et al., 2009) پس از انکوباسیون، مایع رویی کشت جمع‌آوری شد و در دمای ۴ درجه سانتیگراد و ۳۷۰۰ دور در دقیقه به مدت ۲۵ دقیقه سانتریفیوژ شد و پس از آن در همان شرایطی که قبلا برای محلول شکمبه توضیح داده شد، انکوبه شد. ​

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (‏HPLC - DAD

بعد از تیمار آنزیمی پودرها / فیلم‌های پلی استر، پروتئین‌ها با MeOH یخی سرد رسوب داده شدند. نمونه‌ها با ۱۲،۷۰۰ دور در دقیقه در صفر درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی حاصل فیلتر شد (‏فیلترهای ۰.۴۵ mm PA)‏و با یک ویال HPLC پر شد. (Quartinello et al., 2017)

HPLC جفت شده با ستون فاز معکوس C۱۸ برای آنالیز محصولات هیدرولیز با استفاده از گرادیان H۲O / MeOH / HCOOH مورد استفاده قرار گرفت (‏جدول تکمیلی ۲)‏. سرعت جریان به ۰.۸۵ میلی‌لیتر بر دقیقه تنظیم شد و ستون در دمای ۴۰ درجه سانتیگراد نگه‌داشته شد. حجم تزریق ۱۰ میلی‌لیتر بود.

تشخیص آنالیت ها با یک آشکارساز آرایه فوتودیودی در طول‌موج ۲۴۵ نانومتر (‏برای PET و PBAT)‏و ۲۶۰ نانومتر (‏برای PEF)‏انجام شد (‏وینبرگر و همکاران، ۲۰۱۷ b)‏.​

برای تجزیه و تحلیل محصولات هیدرولیز PET، منحنی‌های کالیبراسیون Ta، مونو - ۲ - هیدروکسی اتیل ترفتالات (‏MHET)‏و bis (‏۲ هیدروکسی اتیل)‏ترفتالات (‏BHET)‏تهیه شدند، در حالی که Ta، مونو (‏هیدروکسی بوتیل)‏ترفتالات (‏BTa)‏و bis (‏۴ - هیدروکسی بوتیل)‏ترفتالات (‏BBB)‏برای تشخیص محصول PBAT آزاد شده آماده شدند. (Biundo et al., 2016) منحنی کالیبراسیون استاندارد ۲.۵ - فوراند کربوکسیلیک اسید (‏FDCA)‏برای تعیین کمیت محصولات هیدرولیز PEF مورد استفاده قرار گرفت. (Perz et al., 2016)

میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ(‏SEM)

برای تحقیقات SEM، از یک FEI Quانتا ۲۵۰ FEG (‏علمی ترمو فیشر، هیلزبورو، OR، ایالات‌متحده)‏تحت شرایط خلا بالا و تنش بالا متغیر از ۵ تا ۱۰ کیلو ولت استفاده شد. میکروگراف ها با دتکتور اورهارت تورنلی در حالت الکترونی ثانویه (‏SE)‏ثبت شدند. سطح شکست به منظور ایجاد رسانایی الکتریکی کافی، با لایه نازکی از طلا به اندازه ۱۰ نانومتر پوشیده شده‌است. (Quartinello et al., 2019)

تجزیه و تحلیل جامعه میکروبی

تجزیه و تحلیل جامعه میکروبی

استخراج DNA

DNA کل از یک میلی‌لیتر نمونه شکمبه‌ای جدا شد. Debris و کسر مایع به طور خلاصه برای هموژنیزاسیون نمونه تجزیه شدند، در دو بخش تقسیم شدند و پس از آن سانتریفیوژ شدند. سپس پلت‌ها در ۱۰۰ میلی‌لیتر بافر فسفات ۰.۰۱ مولار احیا شدند. براساس توصیه‌های سازنده، استخراج DNA با استفاده از کیت FastDNA SPIN برای خاک انجام شد. به منظور تعیین خلوص و غلظت DNA برای مطابقت با نیاز گردش کار نانو ذرات , عصاره‌ها با استفاده از کیت QIAamp ویروسی RNA Mini (‏ Qigen )‏ مخلوط و خالص شدند . غلظت DNA با استفاده از فلورومتر Qubit ۲.۰ (‏شرکت Invitata)‏، با کیت Qubit dsDNA مورد ارزیابی قرار گرفت. ​

ساخت کتابخانه، آماده‌سازی قالب، و

سکانسینگ

تجزیه و تحلیل متاژنوم تفنگ ساچمه‌ای با DNA استخراج‌شده بدون هیچ مرحله‌ای از تکثیر توالی‌های هدف انجام شد. برای این منظور، کتابخانه‌های DNA با استفاده از دستورالعمل "DNA ژنومی یک بعدی توسط لیگیشن" موجود در جامعه نانو ذرات آکسفورد با استفاده از کیت ترتیب لیگیشن SQL K - Lsk۱۰۹ و کیت مقدماتی سلول جریان EXP - FLP۰۰۱ (‏نانو ذرات آکسفورد، انگلستان)‏ساخته شدند. تمام مراحل ساخت کتابخانه با توجه به مشخصات پروتکل و با استفاده از ۱ میلی‌گرم ورودی DNA استخراج‌شده انجام شد. پس از آماده‌سازی انتهای DNA برای اتصال آداپتور با استفاده از ترکیب تعمیر DNA NEBside FFPE (‏M۶۶۳۰)‏و ماژول تعمیر و نگهداری NEBside end / dA - Till (‏E۷۵۴۶)‏(‏New UK Biolabs)‏اتصال آداپتورهای توالی (‏که در کیت فراهم می‌شود)‏به انتهای DNA با استفاده از ماژول اتصال سریع NEBNBNREA (‏E۶۰۵۶، New Inus، Biolabs، Ipabs)‏به دست آمد. ​

پس از هر مرحله آماده‌سازی کتابخانه، پاک‌سازی نمونه با استفاده از مهره‌های AMPure XP انجام شد. کنترل کیفیت سلول جریان (‏ نسخه Mk I R9 سلول جریان اسپتون , FLO - Min 106 D )‏ قبل از شروع توالی اجرا شد . برای بررسی تعداد منافذ فعال در سلول جریان از نرم‌افزار MinKNOTM استفاده شد. در نهایت، آماده‌سازی و بارگذاری کتابخانه DNA در سلول جریان با توصیه‌های پروتکل زیر انجام شد. ​

دستگاه نانو (‏MinION)‏به یک کامپیوتر قابل‌حمل متصل شد و نرم‌افزار MinKNOW پس از انتخاب سند پروتکل مناسب راه‌اندازی شد. اجرای توالی به مدت ۳۶ ساعت انجام شد. ​

​

تجزیه و تحلیل متاژنوم Shotgun در میکروبیوم شکمبه، نسبت واقعی تمام حوزه‌های زندگی را نشان داد که نشان‌دهنده تسلط باکتری‌ها (‏۹۸ %)‏و سپس ائوکاریوتا (‏۱ %)‏و در نهایت آرکی ها بود.