بانک جزوات و مقالات تخصصی و کاربردی ترجمه ® ویژه دروس پزشکی ®

نکات کلیدی:

​​​​​​​​

cloning DNA یک تکنیک بیولوژی مولکولی است که تعداد زیادی کپی یک‌سان از یک قطعه DNA مانند یک ژن می‌سازد. ​

در یک آزمایش cloning معمولی، ژن هدف در یک قطعه گرد DNA به نام پلاسمید وارد می‌شود. ​

پلاسمید از طریق فرآیندی به نام transformation به باکتری وارد می‌شود و باکتری‌های حامل پلاسمید با استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها انتخاب می‌شوند. باکتری‌ها با پلاسمید صحیح برای ساخت DNA پلاسمید بیشتر و یا در برخی موارد برای بیان ژن و تولید پروتئین مورد استفاده قرار می‌گیرند. ​

مقدمه

​​​​​​​​

وقتی کلمه "شبیه‌سازی" را می‌شنوید، ممکن است به شبیه‌سازی تمام موجودات زنده مانند دالی گوسفند فکر کنید. با این حال، تمام آن به معنای شبیه‌سازی چیزی است که یک کپی دقیق ژنتیکی از آن ایجاد می‌کند. در آزمایشگاه زیست‌شناسی مولکولی، چیزی که اغلب کلون می‌شود، ژن یا قطعه کوچکی از DNA است. ​

اگر دوست شما، زیست‌شناس مولکولی می‌گوید که "شبیه‌سازی" او کار نمی‌کند، او تقریبا به طور قطع در مورد کپی کردن قطعات DNA صحبت می‌کند، نه ساخت دالی بعدی! ​

مروری بر شبیه‌سازی DNA

​​​​​​​​

cloning DNA فرآیند ساخت نسخه‌های متعدد و یک‌سان از یک قطعه خاص DNA است. قطعه دی ان ای مورد نظر (‏شاید یک ژن برای پروتیین مهم پزشکی انسان)‏برای اولین بار در یک قطعه گرد از دی ان ای به نام پلاسمید وارد می‌شود. وارد کردن با استفاده از آنزیم‌هایی که DNA را cut و paste می‌کنند انجام می‌شود، و یک مولکول DNA نوترکیب تولید می‌کند، یا DNA از قطعات چندین منبع جمع‌آوری می‌شود. ​

نمودار ساخت مولکول DNA نوترکیب را نشان می‌دهد.

یک قطعه گرد از DNA پلاسمید در انتهای خود که با قطعه ژنی مطابقت دارد متصل شده‌است.

قطعه پلاسمید و ژن به هم متصل می‌شوند تا پلاسمید حاوی ژن را تولید کنند.

این پلاسمید حاوی ژن نمونه‌ای از DNA نوترکیب یا مولکول DNA مونتاژ شده از DNA منابع مختلف است.

​​​​​​​​

سپس پلاسمید نوترکیب به باکتری معرفی می‌شود. باکتری‌هایی که پلاسمید را حمل می‌کنند انتخاب می‌شوند و رشد می‌کنند. وقتی آن‌ها تولید مثل می‌کنند، پلاسمید را تکثیر می‌کنند و آن را به فرزندان خود منتقل می‌کنند و کپی DNA حاوی آن را می‌سازند. ​

هدف از ساختن نسخه‌های زیادی از یک توالی DNA در پلاسمید چیست؟ در برخی موارد، ما به تعداد زیادی کپی DNA برای انجام آزمایش‌ها یا ساخت پلاسمیدهای جدید نیاز داریم. در موارد دیگر، قطعه DNA، پروتیین مفیدی را رمز می‌کند و باکتری‌ها به عنوان "کارخانه" برای ساختن پروتیین استفاده می‌شوند. به عنوان مثال، ژن انسولین انسانی در باکتری ای کولای بیان می‌شود تا انسولین مورد استفاده بیماران دیابتی را تولید کند. ​

مراحل کلونینگ DNA

​​​​​​​​

شبیه‌سازی DNA برای بسیاری از اهداف مورد استفاده قرار می‌گیرد. به عنوان مثال، اجازه بدهید که ببینیم که چگونه شبیه‌سازی DNA می‌تواند برای سنتز یک پروتیین (‏مانند انسولین انسان)‏در باکتری‌ها استفاده شود. گام‌های اولیه عبارتند از:

۱. پلاسمید را برش زده و ژن درون آن قرار می گیرد. این فرآیند به آنزیم‌های محدودکننده (‏که DNA را قطع می‌کنند)‏و لیگاز DNA (‏که به DNA ملحق می‌شود)‏وابسته است. ۲. پلاسمید را در باکتری قرار دهید. از انتخاب آنتی‌بیوتیک برای شناسایی باکتری‌هایی که پلاسمید را گرفته‌اند استفاده کنید. ۳. تعداد زیادی از باکتری‌های حامل پلاسمید را جمع کنید و از آن‌ها به عنوان "کارخانه" برای تولید پروتئین استفاده کنید. این پروتئین را از باکتری استخراج و خالص کنید. ۱. برش و چسباندن DNA

چگونه می توان قطعات DNA از منابع مختلف را به هم متصل کرد؟ یک روش معمول از دو نوع آنزیم استفاده می‌کند: آنزیم‌های محدود کننده و ligase DNA. ​

آنزیم محدودکننده یک آنزیم برش DNA است که یک توالی هدف خاص را تشخیص می‌دهد و DNA را به دو قطعه در آن مکان یا نزدیک آن می‌برد. بسیاری از آنزیم‌های محدود کننده انتهای برش را با برآمدگی‌های کوتاه و تک‌رشته‌ای تولید می‌کنند. اگر دو مولکول overhangs مشابهی داشته باشند، می‌توانند جفت باز کنند و به هم بچسبند.

با این حال، آن‌ها ترکیب نخواهند شد تا یک مولکول DNA شکسته را تشکیل دهند تا زمانی که توسط اتصال DNA، که شکاف را در ستون فقرات DNA محکم می‌کند، متصل شوند.

​​​​​​​​

هدف ما در شبیه‌سازی، وارد کردن ژن هدف (‏به عنوان مثال انسولین انسان)‏در پلاسمید است. با استفاده از یک آنزیم محدودکننده که به دقت انتخاب شده‌است، ما هضم می‌کنیم:

این پلاسمید که دارای یک محل برش است

قطعه ژن هدف که دارای یک محل برش نزدیک هر انتهای آن است

سپس ما قطعات را با اتصال DNA ترکیب می‌کنیم که آن‌ها را به ساخت پلاسمید نوترکیب حاوی ژن متصل می‌کند. ​

ما با پلاسمید باکتری دایره‌ای و ژن هدف شروع می‌کنیم. در دو انتهای ژن هدف، مکان‌های محدود کننده و یا توالی‌های DNA شناسایی‌شده توسط یک آنزیم محدود کننده خاص هستند. در پلاسمید، یک جایگاه محدودیت نیز وجود دارد که توسط همان آنزیم، درست بعد از یک پروموتر که بیان را در باکتری‌ها هدایت خواهد کرد، شناسایی شده‌است. ​

هم پلاسمید و هم ژن هدف (‏به طور جداگانه)‏با آنزیم محدودکننده هضم می‌شوند. قطعات خالص شده و ترکیب می‌شوند. آن‌ها "انتهای چسبنده" یا برآمدگی‌های DNA تک‌رشته‌ای را با هم تطبیق می‌دهند تا بتوانند به هم بچسبند. ​

آنزیم DNA اتصال قطعات را با انتهای تطبیق به هم متصل می‌کند تا یک مولکول منفرد و پیوسته DNA را تشکیل دهد. این یک پلاسمید نوترکیب تولید می‌کند که حاوی ژن هدف است. ​

۲. transformation و انتخاب باکتری

پلاسمیدها و دیگر DNA ها می‌توانند در باکتری‌ها، مانند اشریشیا کلی بی‌ضرر مورد استفاده در آزمایشگاه‌ها، در فرآیندی به نام transformation، معرفی شوند. در طول transformation ، به سلول‌های باکتریایی شوک (‏مانند دمای بالا)‏داده می‌شود که آن‌ها را به جذب DNA خارجی تشویق می‌کند. ​

DNA تولید شده توسط ligation (‏که ممکن است ترکیبی از پلاسمیدهای مطلوب، پلاسمیدهای محصول جانبی و قطعات DNA خطی باشد)‏به باکتری‌ها اضافه می‌شود. به باکتری‌ها شوک گرمایی داده می‌شود، که باعث می‌شود آن‌ها با تغییر شکل، DNA را جذب کنند. با این حال، تنها اقلیت کوچکی از باکتری‌ها با موفقیت پلاسمید را به دست خواهند آورد. ​

یک پلاسمید معمولا حاوی ژن مقاومت آنتی‌بیوتیکی است که به باکتری‌ها اجازه می‌دهد تا در حضور یک آنتی‌بیوتیک خاص زنده بمانند. بنابراین باکتری‌هایی که پلاسمید را گرفته‌اند می‌توانند در صفحات مغذی حاوی آنتی‌بیوتیک انتخاب شوند. باکتری‌ها بدون پلاسمید می‌میرند در حالی که باکتری‌ها حامل پلاسمید می‌توانند زنده و تکثیر شوند. هر باکتری زنده مانده باعث ایجاد یک گروه کوچک و یا یک کلونی از باکتری‌های مشابه می‌شود که همگی یک پلاسمید را حمل می‌کنند. ​

پانل چپ: نمودار پلاسمید، نشان می‌دهد که حاوی یک ژن مقاومت آنتی‌بیوتیکی است. ​

قسمت راست: تمام باکتری‌ها از این تغییر شکل در یک صفحه آنتی‌بیوتیک قرار می‌گیرند. باکتری‌ها بدون پلاسمید به خاطر آنتی‌بیوتیک می‌میرند. هر باکتری با پلاسمید یک کلونی یا گروهی از باکتری‌های کلونی می‌سازد که همگی حاوی یک پلاسمید هستند. یک کلونی معمولی شبیه یک نقطه سفید کوچک به اندازه یک سر سوزن است. ​

همه کلونی ها لزوما حاوی پلاسمید مناسب نخواهند بود. این به این دلیل است که در طول ligation، قطعات DNA همیشه به روشی که ما قصد داریم "دست‌نخورده" می‌مانند. در عوض، ما باید DNA را از چندین کلونی جمع‌آوری کنیم و ببینیم که آیا هر کدام حاوی پلاسمید مناسب هستند. روش‌هایی مثل هضم آنزیمی و PCR معمولا برای کنترل پلاسمیدها استفاده می‌شوند. ​

۳. تولید پروتئین

هنگامی که کلونی باکتریایی را با پلاسمید مناسب پیدا کردیم، می‌توانیم یک کشت بزرگ از باکتری‌های حامل پلاسمید را رشد دهیم. سپس به باکتری‌ها یک سیگنال شیمیایی می‌دهیم که به آن‌ها یاد می‌دهد تا پروتئین هدف را تولید کنند. ​

این باکتری به عنوان یک "کارخانه کوچک" عمل می‌کند و مقادیر زیادی پروتئین تولید می‌کند. برای مثال، اگر پلاسمید ما حاوی ژن انسولین انسانی باشد، باکتری‌ها شروع به رونویسی ژن و ترجمه mRNA برای تولید مولکول‌های زیادی از پروتئین انسولین انسانی خواهند کرد. ​

یک کلونی انتخاب‌شده در یک کشت بزرگ رشد می‌کند (‏به عنوان مثال، یک فلاسک ۱ لیتری)‏. باکتری‌ها در کشت بزرگ برای بیان ژن موجود در پلاسمید القا می‌شوند و باعث می‌شوند که ژن به mRNA رونویسی شود و mRNA به پروتیین ترجمه شود. پروتئین کد شده توسط ژن درون باکتری تجمع می‌کند. ​

وقتی پروتئین تولید شد، سلول‌های باکتریایی می‌توانند برای آزاد کردن آن باز شوند. علاوه بر پروتئین هدف (‏مثل انسولین)‏، پروتئین‌های و ماکرومولکول های زیادی نیز در باکتری‌ها شناور هستند. به همین دلیل، پروتیین هدف باید خالص شود و یا با تکنیک‌های بیوشیمیایی از دیگر محتویات سلول‌ها جدا شود. پروتئین خالص شده می‌تواند برای آزمایش‌ها و یا در مورد انسولین به بیماران تجویز شود. ​

کاربردهای شبیه‌سازی DNA

مولکول‌های DNA ساخته‌شده از طریق تکنیک‌های شبیه‌سازی برای اهداف بسیاری در زیست‌شناسی مولکولی مورد استفاده قرار می‌گیرند. یک لیست کوتاه از مثال‌ها شامل موارد زیر است:

Biopharmaceuticals. شبیه‌سازی DNA می‌تواند برای ساختن پروتئین‌های انسانی با کاربردهای پزشکی مانند انسولین ذکر شده در بالا مورد استفاده قرار گیرد. نمونه‌های دیگر پروتئین‌های نوترکیب شامل هورمون رشد انسان است که به بیمارانی داده می‌شود که قادر به سنتز هورمون نیستند و فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (‏tPA)‏که برای درمان سکته و جلوگیری از لخته‌های خون به کار می‌رود. پروتئین‌های نوترکیبی مثل اینها اغلب در باکتری‌ها ساخته می‌شوند. ژن درمانی در برخی اختلالات ژنتیکی، بیماران فاقد شکل عملکردی یک ژن خاص هستند. ژن درمانی تلاش می‌کند یک کپی نرمال از ژن را برای سلول‌های بدن بیمار فراهم کند. برای مثال، شبیه‌سازی DNA برای ساخت پلاسمیدهایی استفاده شد که حاوی یک نسخه نرمال از ژن است که در فیبروز کیستیک غیر عملکردی است. وقتی پلاسمیدها به شش‌های بیماران فیبروز کیستیک تحویل داده شدند، عملکرد ریه به سرعت کاهش یافت. آنالیز ژن. در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی اولیه، زیست شناسان اغلب از شبیه‌سازی DNA برای ساخت نسخه‌های مصنوعی و نو ترکیب از ژن‌ها استفاده می‌کنند که به آن‌ها کمک می‌کند تا درک کنند که چگونه ژن‌های طبیعی در عملکرد یک ارگانیسم عمل می‌کنند. ​

اینها تنها چند نمونه از چگونگی استفاده امروز شبیه‌سازی DNA در زیست‌شناسی هستند. شبیه‌سازی DNA یک تکنیک بسیار رایج است که در انواع عظیمی از کاربردهای زیست‌شناسی مولکولی مورد استفاده قرار می‌گیرد. ​